基因转染血管内皮生长因子促进损伤咬肌的血管生成

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.20.013

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (20): 3699-3706.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.20.013

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基因转染血管内皮生长因子促进损伤咬肌的血管生成

杨书芳¹，郑建金²，董刚²，李涛²，吴双燕³，卢恕来²

1青岛大学医学院附属青岛市市立医院，山东省青岛市 266011
2青岛市市立医院口腔医学中心，山东省青岛市 266011
3青岛市口腔医院，山东省青岛市 266000

收稿日期:2012-10-18 修回日期:2012-11-09 出版日期:2013-05-14 发布日期:2013-05-14
通讯作者: 郑建金，教授，硕士生导师，青岛市市立医院口腔医学中心，山东省青岛市 266011 zhjj19631016@sina.com
作者简介:杨书芳★，女，1987年生，山东省阳信县人，青岛大学在读硕士，主要从事口腔颌面部肿瘤方面的研究。 411703804@qq.com
基金资助:
青岛市科技局重点项目(08-2-1-5-nsh)；青岛市基金项目(11-2-3-2-(7)-nsh)。

Vascular endothelial growth factor gene transfection improves angiogenesis in radioactive damaged masseter muscle

Yang Shu-fang¹, Zheng Jian-jin², Dong Gang², Li Tao², Wu Shuang-yan³, Lu Shu-lai²

1 Qingdao Municipal Hospital, Medical College of Qingdao University, Qingdao 266011, Shandong Province, China
2 Stomatological Center of Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266011, Shandong Province, China
3 Qingdao Stomatological Hospital, Qingdao 266000, Shandong Province, China

Received:2012-10-18 Revised:2012-11-09 Online:2013-05-14 Published:2013-05-14
Contact: Zheng Jian-jin, Professor, Master’s supervisor, Stomatological Center of Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266011, Shandong Province, China zhjj19631016@sina.com
About author:Yang Shu-fang★, Studying for master’s degree, Qingdao Municipal Hospital, Medical College of Qingdao University, Qingdao 266011, Shandong Province, China 411703804@qq.com
Supported by:
the Key Project of Qingdao Municipal Science and Technology Bureau, No. 08-2-1-5-nsh; Qingdao Municipal Foundation, No. 11-2-3-2-(7)-nsh

摘要/Abstract

摘要：

背景：放射线对恶性肿瘤的复发起预防作用，但长期大剂量放射治疗会对周围正常组织造成损害，因此如何预防及治疗放射线对周围组织的损伤一直是关注的焦点。
目的：观察放射治疗对大鼠咬肌组织的损伤情况及基因转染血管内皮生长因子对咬肌组织血管生成的影响。
方法：用直线加速器对Wistar大鼠咬肌组织进行照射，总剂量40 Gy，照射后将重组质粒pcDNA4-HisMax-C/血管内皮生长因子165及空质粒分别转染至大鼠咬肌区。于治疗结束后2周行转化生长因子β1、血管内皮生长因子蛋白免疫组化染色，检测两种蛋白的表达情况，同时在光镜下观察大鼠咬肌组织的病理变化。
结果与结论：放疗损伤组大鼠转化生长因子β1的表达水平明显高于正常对照组，重组质粒基因转染后咬肌组织血管内皮生长因子蛋白表达水平明显高于放疗损伤组、空质粒转染组及正常对照组。提示转化生长因子β1可以促进损伤组织的修复；血管内皮生长因子基因转染可促进放射治疗后咬肌组织血管的生成，从而促进放疗损伤的修复。

关键词: 组织构建, 组织构建与生物活性因子, 放射损伤, 基因转染, 血管内皮生长因子, 转化生长因子β1, 咬肌, 免疫组化, 血管新生, 其他基金

Abstract:

BACKGROUND: Long-term high-dose radiation therapy is important to prevent the recurrence of cancer. But the radioactive rays can also make hurt to the normal tissues. So, researchers focus on the protection of the surrounding normal tissues in the radiotherapy.
OBJECTIVE: To study the impact of radiation on the rat masseter muscle and the revasularization ability of the irradiated tissue by vascular endothelial growth factor gene transfection.
METHODS: The Wistar rats were radiated by linear accelerator at a dose of 40 Gy. And then the irradiated muscle tissues were transfected with pcDNA4-HisMax-C/vascular endothelial growth factor 165 or empty plasmids. After 2 weeks of gene therapy, transforming growth factor β1 and vascular endothelial growth factor protein were determined using immunohistochemical staining, and the pathological change of the rat masseter muscles was observed under a light microscope.
RESULTS AND CONCLUSION: Transforming growth factor β1 protein was highly expressed in the irradiated tissue than the control tissue. Vascular endothelial growth factor protein was significantly increased in the gene transfected group than the radiation group, empty plasmid DNA transfection group and normal control group. These findings indicate that transforming growth factor β1 can improve damaged tissue repair, and vascular endothelial growth factor gene therapy can resume the ability of revasularization of irradiated tissue, thereby promoting irradiated tissue repair.

Key words: tissue construction, tissue construction and bioactive factor, irradiation injury, gene transfection, vascular endothelial growth factor, transforming growth factor beta 1, masseter muscle, immunohistochemistry, angiogenesis, other grants-supported paper

中图分类号:

R318

杨书芳，郑建金，董刚，李涛，吴双燕，卢恕来. 基因转染血管内皮生长因子促进损伤咬肌的血管生成[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(20): 3699-3706.

Yang Shu-fang, Zheng Jian-jin, Dong Gang, Li Tao, Wu Shuang-yan, Lu Shu-lai. Vascular endothelial growth factor gene transfection improves angiogenesis in radioactive damaged masseter muscle[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(20): 3699-3706.

图/表（结果） 6

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引言

口腔颌面部恶性肿瘤患者大部分需要放疗^[1]。放射线能对恶性肿瘤细胞的分裂起抑制作用，但也对正常组织产生损害，放疗后早期可见血管内膜肿胀而引起血供减少，晚期则因血管增厚、内皮细胞增生造成血管狭窄、闭塞，导致血供锐减或终止，引起局部功能障碍^[2]。因此，在放射治疗过程中加强对肿瘤周围正常组织的防护，减少对血管内皮细胞的损伤是治疗中急待解决的关键问题。

血管内皮生长因子是一种特异性生长因子，能促进血管内皮细胞的分裂、增生、游走、迁移，从而促进新生血管生成^[3-6]。已有研究证实，血管内皮生长因子可以促进血管内皮细胞的增殖，从而提高毛细血管密度^[7]。因此血管内皮生长因子被广泛研究并应用于各种缺血性疾病如冠状动脉粥样硬化性心脏病、脑缺血、周围神经炎等的治疗^[8-10]。也有研究者将其应用于移植皮瓣，以促使其血管化，提高皮瓣存活率^[11]。但血管内皮生长因子基因转染在放疗损伤的防护，尤其是口腔颌面部组织的防护及治疗中的研究较少。

转化生长因子是一类具有多种生物活性的细胞因子，参与生命的各种进程和多种细胞反应，如细胞的增殖、分化、发育和凋亡等过程。近年来有研究证实，转化生长因子β1在组织修复的早期十分活跃^[12]。转化生长因子β1在辐射损伤的组织或器官中表达增高，可促进组织上皮细胞的增生、基质细胞的沉淀，并可进一步诱导纤维组织增生及瘢痕形成，从而促进损伤组织脏器的修复。

实验对大鼠咬肌组织进行放射治疗，以模拟口腔颌面部恶性肿瘤患者接受放射治疗后的状态，探讨放疗前后大鼠咬肌组织的组织形态变化，并将重组质粒转染至大鼠放射损伤的咬肌组织中,检测转化生长因子β1及血管内皮生长因子蛋白的表达情况，观察放疗对组织血管的损伤情况，同时观察血管内皮生长因子基因转染对促进放疗损伤区域血管的新生情况，以期为临床放疗中对肿瘤周围正常组织的防护提供实验依据。

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2011年10月至2012年7月在青岛市市立医院动物实验室及病理科完成。

材料：

实验动物：SPF级Wistar大鼠60只，体质量300- 350 g，均为雄性。山东鲁抗-SLXK提供，许可证号：鲁20080002，大鼠按随机数字表法分为3组，放射损伤组20只，放射损伤+基因转染组20只，放射损伤+空质粒组20只，以对侧非照射咬肌作为正常对照(n=20)。

基因转染血管内皮生长因子促进损伤咬肌的血管生成主要试剂及仪器：

Main reagents and instruments:

方法：

大鼠放射损伤模型的建立：用直线加速器6 MeV对大鼠一侧咬肌区进行照射，5 Gy/次，2次/周，共40 Gy。周围组织用1.2 cm厚的铅板进行防护。

血管内皮生长因子基因转染：于放疗结束后1 d，选一组作为血管内皮生长因子治疗组，进行pcDNA4- HisMax-C/血管内皮生长因子165基因转染(50 μg/只)，另一组转染空质粒(50 μg/只)，作为治疗对照组，共治疗3次，间隔1周。于治疗结束后2周，行血管内皮生长因子、转化生长因子β1蛋白检测及光镜下血管病理改变的观察。

组织病理学观察：取大鼠咬肌组织，置于体积分数10%甲醛溶液固定12 h，石蜡包埋，常规苏木精-伊红染色，于光学显微镜下观察血管病理改变。

免疫组化：兔抗鼠多克隆抗体转化生长因子β1(一抗浓度为1∶100)、兔抗鼠多克隆抗体血管内皮生长因子A(一抗浓度为1∶200)，严格按照试剂盒说明书进行操作。

主要观察指标：①实验大鼠的临床指征变化、咬肌的组织病理学改变及转化生长因子β1、血管内皮生长因子蛋白的表达情况。②结果判断：转化生长因子β1、血管内皮生长因子免疫组化结果均以胞浆或胞膜出现棕黄色颗粒为阳性。根据染色强度及细胞阳性数综合分析，结果分为阴性(-)、弱阳性(+)、中度阳性(++)、强阳性(+++)。

统计学分析：统计结果为等级资料，由第一作者采用SPSS 17.0统计软件以Kruskal-Wallis 检验对统计结果进行分析，两两比较用Mann-Whitney检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

在口腔颌面部恶性肿瘤的治疗中，放射治疗对于预防肿瘤的复发和转移起着非常重要的作用，有研究表明，对于早期口腔癌患者行放射治疗，其5年生存率可高达95%^[13]。但是放疗后对口腔周围正常组织可能产生损害，如软组织的红肿、溃疡，甚至萎缩、咀嚼肌纤维化等，硬组织如颌骨及颞骨的放射性骨坏死等，对患者的生活质量造成很大影响。Louise Kent等^[14]通过对头颈部恶性肿瘤需进行放疗的患者进行放疗后效果观察，发现治疗剂量的放射治疗即可造成45%患者的咬肌挛缩和萎缩，影响患者生活质量。李志民等^[15]建立了大鼠咬肌辐射损伤的模型，发现大鼠照射后咬肌血管内血栓形成，内皮细胞增厚，组织间隙炎症细胞浸润等，部分发生口腔黏膜炎，并且体质下降，体质量明显减轻，部分大鼠由于恶病质死亡。在本实验中，大鼠经40 Gy照射后取咬肌组织经苏木精-伊红染色后观察，咬肌组织肌纤维有错乱，血管内皮肿胀，组织间隙炎症细胞浸润，提示咬肌出现了放射性损伤。

放疗对周围组织的损伤的机制主要为低细胞活性、低血管密度、低氧含量。对于放疗损伤的主要治疗有高压氧治疗、超声波治疗及相应的对症治疗等，但是效果不甚显著。近来，越来越多的研究者通过增加血管扩张药物来促进血管新生，增加血供来治疗放射损伤，收到良好效果^[16]。

转化生长因子β1是一种多功能的细胞因子，目前研究证实，其参与组织创伤后修复过程，可促进创伤愈合^[17-19]。创伤早期表达的转化生长因子β1可促使炎症细胞和成纤维细胞到达创口，与相应受体结合，诱导其他生长因子，对组织修复起到正调节作用^[20-21]。刘慧等^[22]对大鼠心脏组织进行放疗后对其转化生长因子β1水平进行检测，发现在放疗后早期转化生长因子β1与正常对照组比较差异有显著性意义，提示转化生长因子β1在放疗后早期对创伤修复起促进作用。在本实验中，对大鼠照射结束后的咬肌组织进行免疫组化染色，结果放射损伤组转化生长因子β1高表达于正常对照组，这也说明转化生长因子β1在大鼠放射损伤的早期修复中发挥重要作用。转化生长因子β1发挥作用主要是通过参与细胞之间的信号传导来调控内皮细胞分化和迁移，促使毛细血管环的形成，募集血管平滑肌细胞包绕血管腔，从而在血管形成中发挥其作用^[23-24]。

Dickson等^[25]认为在血管发生早期，转化生长因子β1在内皮细胞分化、内皮细胞与基质分子的相互作用中起到至关重要的作用。体外亦有研究证实,转化生长因子β1对内皮细胞生长、迁移、内皮细胞外基质沉积以及内皮细胞融合形成毛细血管过程中起正向调节作用，并能够调节血管管径的大小^[26]。在Liu等^[27]的研究中，对大鼠直肠进行照射，发现照射后直肠中转化生长因子β1的mRNA及蛋白水平均呈现出高表达状态。沈宗泽等^[28]研究证明，大鼠咀嚼肌经直线加速器照射4周后，咬肌组织的转化生长因子β1mRNA水平明显高于正常对照组，这与本实验免疫组化结果是一致的。有研究证实，转化生长因子β1可以促进血管内皮生长因子的表达，促使血管新生^[29-30]。夏鹏等^[31]利用大鼠建立皮肤切创模型,发现血管内皮生长因子、转化生长因子β1在创伤恢复中发挥重要作用，并且它们的表达在创伤修复过程中呈现时序性规律。对于血管内皮生长因子、转化生长因子β1之间的表达是否具有相关性，有待进一步研究。

血管内皮生长因子是一种特异性的血管内皮细胞,是目前已知的最重要的促血管生成因子^[32-33]。血管内皮生长因子家族由血管内皮生长因子A、胎盘生长因子、血管内皮生长因子B、血管内皮生长因子C、血管内皮生长因子D和血管内皮生长因子E组成，其中血管内皮生长因子A 对于血管生成过程中的正常生理状态及病理状态起到重要作用，血管内皮生长因子165是血管内皮生长因子A中最丰富的异构体，与肝素具有较好的亲和力，在各种细胞中表达占优势，是血管内皮生长因子家族中发挥生物学效应的主要成分^[34-35]。

1998年Taub等^[36]首次向血管内注射血管内皮生长因子基因，发现能够促进血管再生，自此血管内皮生长因子被广泛研究。早期有研究者将血管内皮生长因子基因转染至链脲霉素引导的糖尿病大鼠体内，发现可以促进大鼠的血管再生^[37]。已有研究表明，血管内皮生长因子基因转染可以促进心血管缺血性疾病的治疗和功能修复^[38]。Losordo等^[39]将编码的血管内皮生长因子裸质粒转移到患者左室心肌内，发现可以改善心肌缺血患者的心肌血流，延长运动的耐受时间，可以明显提升心肌功能，证明了利用血管内皮生长因子质粒基因治疗具有解决心肌缺血的可行性。Muona等^[40]通过对下肢缺血性损伤患者行局部血管内皮生长因子基因转染后的10年安全随访调查显示，在血管内皮生长因子基因治疗组，其癌症、糖尿病及视网膜病变等其他疾病的发病率同正常对照组差异无显著性意义，这说明血管内皮生长因子基因治疗是安全可靠的，为血管内皮生长因子进一步应用于其他方面提供依据。Enestvedt等^[41]在研究中，利用血管内皮生长因子质粒对胃肠手术患者的吻合口处进行基因治疗，发现可以促使其毛细血管增长，从而改善胃肠吻合术后的愈合情况。Vera Janavel等^[42]将pVEGF注入急性心肌缺血的绵羊心肌内，2个月后对其梗死面积进行检测, pVEGF注射组相较于对照组阻塞面积小30%，结果表明血管内皮生长因子可以促使梗死面积减少, 也说明了血管内皮生长因子的潜在临床应用价值。

赵宁等^[43]将血管内皮生长因子质粒转染入血管内皮细胞，发现血管内皮生长因子植入早期即可诱导新生血管形成，证实血管内皮生长因子转染是促进内皮细胞早期形成新生血管的有效途径。霍文艳等^[44]将血管内皮生长因子逆行注射入小型猪的腮腺导管后对小型猪腮腺进行放射治疗，于放疗结束后行苏木精-伊红及免疫组化染色，结果证明放疗前导管逆行注射血管内皮生长因子可使放疗后腮腺内微血管密度升高。但国内外对于放疗后咬肌组织损伤修复的研究较少。在本实验中，将血管内皮生长因子基因转染入经放疗损伤的咬肌组织中, 经检测, 基因转染组与空质粒组、正常对照组及放疗损伤组比较，血管内皮生长因子蛋白的表达明显增高。王代友等^[45]的研究显示，血管内皮生长因子基因转染大鼠放疗组织后，血管内皮生长因子蛋白明显高于正常组织，放疗组织的血管结构也基本恢复正常。Heikura等^[46]血管内皮生长因子基因转染入新西兰兔的骨骼肌中，6 d后发现其毛细血管数和基因的表达都明显高于对照组, 本实验结果与之一致。在本实验中, 放疗损伤组、放疗损伤+空质粒组、放疗损伤均与正常对照组血管内皮生长因子蛋白的差异无显著性意义。有研究证明，经放疗，组织局部缺氧，也可应激性促进血管内皮生长因子短时间内表达升高，但是但在两三天内会急剧减少，不能尽快恢复内皮细胞的完整性，因此需血管生成关键时期及时补充足量血管内皮生长因子^[43,47]。沈宗泽等^[28]RT-PCR显示基因转染后血管内皮生长因子 mRNA表达明显增高，这也与本实验结果一致。

在本实验中，作者对大鼠咬肌组织进行放射，放射结束后给予血管内皮生长因子基因转染，实验结果显示转化生长因子β1在放疗后表达明显升高，可促进放疗损伤组织的修复，血管内皮生长因子基因转染可以促进损伤咬肌组织血管的修复，为血管内皮生长因子应用于临床放疗防护等提供了实验依据。

基因转染血管内皮生长因子促进损伤咬肌的血管生成

Vascular endothelial growth factor gene transfection improves angiogenesis in radioactive damaged masseter muscle

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